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內(nèi)切酶的酶切技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理值得關(guān)注！

發(fā)布時(shí)間： 2021-06-22　　點(diǎn)擊次數(shù)： 2653次

　　內(nèi)切酶是從細(xì)菌中分離出來(lái)的一種能在特異位點(diǎn)切割DNA分子的核酸內(nèi)切酶，目前已從多種細(xì)菌中分離出超過400種，識(shí)別各自不同的核苷酸順序，這一順序大多為具有一對(duì)稱中心的回文序列，如從大腸桿菌中分離的EcoR I識(shí)別：…GAATTC…切割后產(chǎn)生

　　…CTTAAG…

　　…G和AATTC…的末端

　　…CTTAA G…

　　該末端由于有一段小的能互補(bǔ)配對(duì)的單鏈突出，故稱為粘性末端。切割后的末端為3’-OH和5’-磷酸基團(tuán)。即…G-OH

　　…CTTAA-P。

　　有的限制性酶識(shí)別四堿基對(duì)的順序，如San3A識(shí)別GATC；有的識(shí)別六堿基對(duì)，如上述的ECOR I。識(shí)別四堿基對(duì)的內(nèi)切酶由于識(shí)別順序在DNA出現(xiàn)的頻率更高（四堿基酶為44=256，六堿基酶為46＝4096），因而可將DNA切割成更小的片段，而識(shí)別八堿基對(duì)的Not I

　　…GCGGCCGC…

　　…CGCCGGCG…。

　　則識(shí)別和切割位點(diǎn)更少（48＝65536），但堿基并不以均等的概率出現(xiàn)，因而切割后產(chǎn)生的片段變化范圍很大。

　　限制性內(nèi)切酶作用的溫度一般為37℃，反應(yīng)體系中以Mg2＋為單獨(dú)的輔助因子，且要求pH緩沖在7.5左右。

　　商品酶都保存在50％的甘油溶液中，-20℃貯存，活性通常較高，5u/μl（每單位即最適條件下1小時(shí)內(nèi)*酶解1μg DNA的酶量）。

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