內切酶一般從微生物中獲取，限制性核酸內切酶的作用實際就是限制酶降解外源DNA，維護宿主遺傳穩定的保護機制。自身DNA沒有被分解的原因是通過自身DNA甲基化，甲基化是常見的修飾作用，可使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化而受到保護，即讓它們在甲基轉移酶的作用下，與甲基發生共價結合。通過甲基化作用達到識別自身遺傳物質和外來遺傳物質的目的。
限制性核酸內切酶識別序列的結構情況：
根據限制酶的結構，輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為三種類型，分別是第①型（Type I）、第②型（TypeⅡ）及第③型（TypeⅢ）。
Type I：
同時具有修飾及識別切割的作用；另有識別DNA上特定堿基序列的能力，通常其切割位距離識別位可達數千個堿基之遠。
TypeⅡ：
Ⅱ類中的限制性內切酶在分子克隆中得到了廣泛應用，它們是重組DNA的基礎。
只具有識別切割的作用，修飾作用由其他酶進行。所識別的位置多為短的回文序列；所剪切的堿基序列通常即為所識別的序列。是遺傳工程上，實用性較高的限制酶種類。
Ⅱ類酶切割位點在識別序列中，有的在對稱軸處切割，產生平末端的DNA片段；有的切割位點在對稱軸一側，產生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性末端，如EcoRⅠ切割識別序列后產生兩個互補的粘性末端。
TypeⅢ：
與一型限制酶類似，同時具有修飾及識別切割的作用。可識別短的不對稱序列，切割位與識別序列約距24-26個堿基對。
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